生物顯微鏡與光學(xué)濾光片 （此文章為轉(zhuǎn)載）

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一、暗視野顯微鏡

(一) 原理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 

在日常生活中，室內(nèi)飛揚(yáng)的微粒灰塵是不易被看見的，但在暗的房間中若有一束光線從門縫斜射進(jìn)來，灰塵便粒粒可見了，這是光學(xué)上的丁達(dá)爾現(xiàn)象。暗視野顯微鏡就是利用此原理設(shè)計(jì)的。它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)主要是使用中央遮光板或暗視野聚光器，常用的是拋物面聚光器，使光源的中央光束被阻擋．不能由下而上地通過標(biāo)本進(jìn)入物鏡。從而使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的標(biāo)本上，標(biāo)本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡內(nèi)，因而整個(gè)視野是黑暗的。

在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像．并非物體的本身，所以只能看到物體的存在和運(yùn)動(dòng)，不能辨清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)。但被檢物體為非均質(zhì)時(shí)，并大于1／2波長，則各級(jí)衍射光線同時(shí)進(jìn)入物鏡，在某種程度上可觀察物體的構(gòu)造。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運(yùn)動(dòng)，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性，可用以觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)微粒的運(yùn)動(dòng)等。 

(二) 制作中央遮光板 
普通顯微鏡只要聚光器是可以拆卸的，支架的口徑適于安裝暗視野聚光器，即可改裝成暗視野顯微鏡。在無暗視野聚光器時(shí)，可用厚黑紙片制作一個(gè)中央遮光板，放在普通顯微鏡的聚光器下方的濾光片框上，也能得到暗視野效果。

1．將顯微鏡聚光器調(diào)到最高位置，用低倍鏡對(duì)好焦距。 

2．取下目鏡，從鏡筒中觀察并調(diào)節(jié)光闌的大小，使其與鏡筒中所見物鏡的視野相等。 

3．用厚黑紙剪制中央擋光板。外圈直徑與濾光片框架相同，中央部分的大小與調(diào)節(jié)好的光闌孔徑一樣(可用半透明的小紙片，放在通光孔處聚光鏡鏡面上，紙上顯示的光斑即為光闌的孔徑，再用圓規(guī)量取大小)。 

4．將中央擋光板放在濾光片框架上，開大光闌進(jìn)行樣品觀察。 

如需使用高倍鏡作暗視野觀察，應(yīng)按高倍鏡對(duì)焦后的視野大小重新制作中央擋光板。 

保存好各自制作的中央遮光板，以便在后面的實(shí)驗(yàn)中使用。 

（三）使用方法 

1．把暗視野聚光器裝在顯微鏡的聚光器支架上。 

2．選用強(qiáng)的光源，但又要防止直射光線進(jìn)入物鏡，所以一般用顯微鏡燈照明。 

3．在聚光器和標(biāo)本片之間要加一滴香柏油，目的是不使照明光線于聚光鏡上面進(jìn)行全反射，達(dá)不到被檢物體，而得不到暗視野照明。 

4．升降集光器，將集光鏡的焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)被檢物體，即以圓錐光束的頂點(diǎn)照射被檢物。如果聚光器能水平移動(dòng)并附有中心調(diào)節(jié)裝置，則應(yīng)首先進(jìn)行中心調(diào)節(jié)，使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴(yán)格位于一直線上。 

5．選用與聚光器相應(yīng)的物鏡，調(diào)節(jié)焦距 操作方法與普通顯微鏡相同，找到所需觀察的物像。 

（四）觀察 觀察示教臺(tái)上暗視野顯微鏡下的活細(xì)胞。在黑暗的背景里，可見細(xì)胞、細(xì)胞核和細(xì)胞器的衍射光圖像。 

二、相差顯微鏡 

(一) 原理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 

光波有振幅（亮度）、波長（顏色）及相位(指在某一時(shí)間上光的波動(dòng)所能達(dá)到的位置)的不同。當(dāng)光通過物體時(shí)，如波長和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才能觀察到，這就是普通顯微鏡下能夠觀察到染色標(biāo)本的道理。而活細(xì)胞和未經(jīng)染色的生物標(biāo)本，因細(xì)胞各部微細(xì)結(jié)構(gòu)的折射率和厚度略有不同，光波通過時(shí)，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位有變化(相應(yīng)發(fā)生的差異即相差)，而這種微小的變化，人眼是無法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到。相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變成振幅差(明暗差)，同時(shí)它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活細(xì)胞或未染色標(biāo)本。 

相差顯微鏡(圖2-3)與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相板的物鏡(通常標(biāo)有PH的標(biāo)記)代替普通物鏡，并帶有一個(gè)合軸用的望遠(yuǎn)鏡。環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。其作用是將直射光所形成的像從一些衍射旁像中分出來。相板安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。調(diào)軸望遠(yuǎn)鏡是用來進(jìn)行合鈾調(diào)節(jié)的。相差顯微鏡在使用時(shí)，聚光鏡下面環(huán)f狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上，必需調(diào)節(jié)光闌的亮環(huán)和相板的環(huán)狀圈重合對(duì)齊，才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應(yīng)被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就失去了相差顯微鏡的作用。 

(二)使用方法 相差裝置為多功能系列顯微鏡中的附屬裝置．與普通顯微鏡配合使用。

1．相差裝置的調(diào)換安裝 卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上，把綠色濾光片放在上面，它可吸收紅色和藍(lán)色光，使波長范圍小的單色光線進(jìn)行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。再從轉(zhuǎn)換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡。 

2．調(diào)焦 打開光源，旋轉(zhuǎn)集光器轉(zhuǎn)盤，將“o”對(duì)準(zhǔn)標(biāo)示孔，使普通聚光器部分進(jìn)入光路。先使用低倍相差物鏡，按普通顯微鏡操作方法進(jìn)行對(duì)光和調(diào)焦。 旋轉(zhuǎn)環(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應(yīng)，如相差物鏡為40 x時(shí)應(yīng)用x40標(biāo)示孔的光闌。 

3．合鈾調(diào)整 拔出目鏡，插入合鈾望遠(yuǎn)鏡，一邊從望遠(yuǎn)鏡內(nèi)內(nèi)觀察，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉(zhuǎn)動(dòng)望遠(yuǎn)鏡內(nèi)筒使其下降，當(dāng)對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的黑環(huán)，此時(shí)可將望遠(yuǎn)鏡固定住。再升降集光器并調(diào)節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與黑環(huán)一致，然后左右前后調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上的調(diào)節(jié)鈕，使兩環(huán)完全重合＜圖2—4，如亮環(huán)比黑環(huán)小而位于內(nèi)側(cè)時(shí)，應(yīng)降低集光器使亮環(huán)放大；反之，則應(yīng)升高聚光器，使亮環(huán)縮小。如若升到最高限度仍不能完全重合，則可能是載玻片過厚之故，應(yīng)更換。合抽調(diào)整完畢，抽出望遠(yuǎn)鏡，換回目鏡，按常規(guī)要領(lǐng)進(jìn)行觀察。在更換不同倍率的相差物鏡時(shí)，每一次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌和重新合抽調(diào)整。使用油鏡時(shí)，集光器上透鏡表面與載玻片之間要同時(shí)加上香伯泊。 

(三)觀察 在相差顯微鏡下觀察活細(xì)胞，可清楚地分辨細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞核、核仁以及胞質(zhì)中存在的顆粒狀結(jié)構(gòu)。

三、熒光顯微鏡 

(一)原理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 

熒光顯微鏡是利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光3650入或紫藍(lán)光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀察。這樣在強(qiáng)烈的對(duì)襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認(rèn)，敏感性高，主要用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學(xué)成分等的研究。 熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎(chǔ)上組成的。熒光光源一般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個(gè)產(chǎn)生最強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標(biāo)本上，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛?二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。

熒光顯微鏡就其光路來分有兩種：

1．透射式熒光顯微鏡 激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標(biāo)本材料來激發(fā)熒光的(圖2—5)。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調(diào)節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標(biāo)本上．這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng)，而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱．所以對(duì)觀察較大的標(biāo)本材料較好。

2．落射式熒光顯微鏡 這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡(圖2-6)。光路中需加上一個(gè)雙色束分離器，它與光鈾呈45。角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng)。

（二）使用方法．

1．打開燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達(dá)到最亮點(diǎn)。 

2．透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的插塊。 

3．用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號(hào)熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中心，使其位于整個(gè)照明光斑的中央。 

4．放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。 使用中應(yīng)注意：末裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須用無熒光

特殊油鏡；高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動(dòng)，否則會(huì)不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。

(三)觀察 在示教臺(tái)上的熒光顯微鏡下用藍(lán)紫光濾光片，可見經(jīng)o．01％的丫啶橙熒光染料染色的細(xì)胞，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。